Optimizing the Biosynthesis of Dihydroquercetin from Naringenin in Saccharomyces cerevisiae酿酒酵母中以柚皮素为底物合成二氢槲皮素的生物合成优化摘要二氢槲皮素DHQ具备多种生理活性在食品、化工及医药行业应用广泛。然而二氢槲皮素生物合成过程中中间产物大量积累严重制约其二氢槲皮素的合成效率。本研究将来源于不同物种的黄烷酮-3-羟化酶F3H、类黄酮-3′-羟化酶以及细胞色素 P450 还原酶基因整合至酵母染色体实现二氢槲皮素的生物合成。借助计算机辅助蛋白设计筛选得到最优 F3H 突变体 P221A相较于对照组该突变体将柚皮素NAR转化生成二氢槲皮素的产量提升 1.67 倍。后续通过酶促反应解析与培养基组分优化以 800 mg/L 柚皮素为底物最终合成得到 637.29 ± 20.35 mg/L 二氢槲皮素底物转化率高达 71.26%是目前已报道柚皮素合成二氢槲皮素的最高水平之一。1 引言二氢槲皮素DHQ俗称花旗松素是一类植物来源的活性类黄酮但植物体内含量极低小于 3%(1)。二氢槲皮素分子包含 A、B 两个苯环二者经由杂环 C 环相连(2)。该独特分子结构赋予二氢槲皮素多样的药理活性包括抗氧化(3)、抗癌(4)、肝保护(5)以及多重神经保护活性(6)是大量膳食补充剂与功能食品的核心功能成分。传统获取二氢槲皮素的方式主要为从落叶松木材中提取(7)。但植物提取工艺存在产物稳定性差、提取效率低下等问题。二氢槲皮素存在 4 种立体异构体不同异构体生物活性与体内分布均存在差异。尽管已有这些立体异构体的化学合成报道但手性拆分仍需借助手性反相高效液相色谱操作繁琐且耗时。此外利用愈伤组织粗酶液合成类黄酮的方案整体转化效率偏低(8,9)。相较于传统合成手段细胞工厂代谢工程已经成为高效、可持续生产高价值天然产物的优选策略。该技术具备生产周期短、生产强度高、不受季节条件限制等优势同时生物合成的下游处理流程通常比植物提取更为简便(10)。大肠杆菌、酿酒酵母等模式微生物已成功改造可生物合成多种类黄酮物质包括花青素(11,12)、灯盏花乙素(13)、儿茶素(14)以及山奈酚(15)。已有研究表明二氢槲皮素可由关键代谢物柚皮素NAR经特定位点羟基化生成。通路存在两条分支其一黄烷酮-3-羟化酶F3H催化 (2S)柚皮素生成 (2R,3R)二氢山奈酚DHK再经 B 环 3 位羟基化生成 (2R,3R)二氢槲皮素(16)其二类黄酮3′羟化酶F3′H先将 (2S)柚皮素转化为 (2S)圣草酚ERI再对 C 环 3 位进行羟基化最终得到 (2R,3R)二氢槲皮素。已有研究报道解脂耶氏酵母通过表达分支酸、丙二酰辅酶 A 合成相关基因能够实现二氢槲皮素的从头合成(17)。有研究通过筛选氧化还原配对蛋白、开展酶工程改造结合全细胞催化条件优化在大肠杆菌体系实现 0.66 g/g 的二氢槲皮素底物得率(18)。还有研究对生物合成通路进行改造优化细胞色素 P450 信号肽以甘油为碳源大肠杆菌可产出 239.4 mg/L 二氢槲皮素(19)。另有报道通过修饰 F3′H 蛋白预测泛素化位点提升胞内蛋白稳定性对不同 F3H 酶与启动子组合进行筛选获得最优工程菌株以 1 g/L 柚皮素为底物二氢槲皮素滴度可达 381.2 ± 10.7 mg/L(20)。综合上述研究可以发现二氢槲皮素合成普遍存在中间产物大量积累的问题圣草酚、二氢山奈酚、柚皮素等中间体同时大量生成。F3′H 与 F3H 是柚皮素羟基化限速步骤的关键酶(2123)。蛋白工程是解决该瓶颈最具潜力的手段包括定向进化、理性设计、计算机辅助设计以及机器学习辅助设计(24,25)通过蛋白改造可以提升酶的催化效率(26)、热稳定性(27)、底物选择性(28)以及 pH 适应能力(29)助力类黄酮高效合成。目前虽然已经鉴定出多种 F3′H、F3H 酶但针对不同来源酶合成二氢槲皮素的活性对比研究仍较为匮乏。本研究筛选不同来源的 F3H 酶搭配氧化还原伴侣蛋白细胞色素 P450 还原酶确定最优基因拷贝数对二氢槲皮素生物合成通路进行优化。借助分子对接筛选得到 P221 位点突变该突变可在整个发酵周期提升 F3H 催化效率。结合菌株生理特征进一步优化发酵培养条件发酵 144 h 后以 800 mg/L 柚皮素为底物最终得到 637.29 ± 20.35 mg/L 二氢槲皮素。2 材料与方法2.1 化学试剂与标准品本实验所用色谱级标准品(2S)柚皮素、(2R,3R)二氢山奈酚、(2S)圣草酚、(2R,3R)二氢槲皮素购自宝鸡赫博生物科技有限公司。色谱纯乙腈购自德国默克公司。其余化学试剂均为分析纯。2.2 基因、质粒与菌株苹果Malus domestica黄烷酮3羟化酶MdF3H、草莓Fragaria ananassa黄烷酮3羟化酶FaF3H、非洲菊Gerbera hybrid类黄酮3′羟化酶GhF3′H、拟南芥Arabidopsis thaliana细胞色素 P450 还原酶AtCPR、水飞蓟Silybum marianum细胞色素 P450 还原酶SmCPR基因均经过密码子优化由南京金唯智生物科技有限公司合成。本研究所用酶信息如表 1 所示。Enzymes Used in This Studyabb.nameorganismreactionMdF3Hflavanone-3-hydroxylaseMalus domesticaERI 2OG O2 → DHQ succinate CO2FaF3Hflavanone-3-hydroxylaseFragaria ananassERI 2OG O2 → DHQ succinate CO2GhF3′Hflavonoid-3′-hydroxylaseGerbera hybridNAR redCPR O2→ ERI oxCPR H2OAtCPRcytochrome P450 reductaseArabidopsis thalianaoxF3′H NADPH → redF3′H NADP HSmCPRcytochrome P450 reductaseSilybum marianumoxF3′H NADPH → redF3′H NADP H本研究使用的所有菌株与质粒详见附表 S1。所有组装完成的质粒在转化酿酒酵母前均进行测序验证。酿酒酵母采用醋酸锂法完成转化(30)。大肠杆菌 DH5α 用于克隆操作。所用引物由北京擎科生物或上海生工生物合成引物序列详见附表 S2。参照已有实验方案利用 CRISPR/Cas9 系统实现单拷贝位点整合(31)。基于 CRISPOR 在线网站http://crispor.tefor.net/筛选特异性向导 RNA通过重组臂将目的基因整合至酵母 X3 染色体位点。随后向酵母细胞转入 CRISPR/Cas9 辅助质粒。利用含有 5氟乳清酸的培养基对 URA3 基因进行反筛选去除 CRISPR/Cas9 质粒。2.3 培养基与培养条件大肠杆菌 DH5α 培养于 LB 培养基5 g/L 酵母提取物、10 g/L 胰蛋白胨、10 g/L 氯化钠摇床ZQZYCF9.9上海知楚仪器有限公司培养条件37 ℃250 rpm。质粒构建时使用添加 100 mg/L 氨苄青霉素的 LB 培养基。酵母菌株采用 YPD 培养基10 g/L 酵母提取物、20 g/L 蛋白胨、20 g/L 葡萄糖摇瓶培养30 ℃200 rpm。预培养 16 h 后取 25 μL 种子液接种至含有 2.5 mL YPD 培养基的试管中同时加入柚皮素底物200 mg/L、800 mg/L 或 1 g/L继续培养 96168 h。携带表达质粒的酵母通常先在 SCURA 培养基0.77 g/L CSMURA、1.7 g/L 酵母氮源、5 g/L 硫酸铵、20 g/L 葡萄糖30 ℃培养 24 h之后按 1% 接种量转接到 YPD 培养基进行发酵。使用十二水磷酸氢二钠13.62 g/L与二水磷酸二氢钠9.68 g/L将 YPD 培养基 pH 调至 6.0培养基优化组额外添加 0.5 mM 硫酸亚铁Fe²⁺与 1 mM α酮戊二酸。2.4 计算机辅助设计在 UniProt 数据库https://www.uniprot.org/检索 MdF3H 酶登录号 Q06942从 AlphaFoldDB 获取该酶预测三维结构。分子对接前使用 AutoDock Toolshttps://autodock.scripps.edu对 MdF3H 结构添加极性氢并补充电荷。从 NCBI 数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/获取 α-酮戊二酸2OG与圣草酚ERI的分子结构通过 AutoDock Tools 完成能量最小化并释放全部可旋转二面角。采用 AutoDock Vina 开展分子对接模拟依据对接打分评价配体受体结合亲和力。借助 Protein-Ligand Interaction Profiler 网站https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index分析潜在参与氢键、疏水相互作用的氨基酸位点(32)。使用 PyMOL 软件www.pymol.org解析对接结果筛选若干候选氨基酸残基用于后续突变实验。2.5 定点突变定点突变所用引物见附表 S2。以 p416MD 质粒为模板使用 2×Phanta Max Master Mix诺唯赞中国进行全质粒 PCR 扩增引入目标突变。PCR 程序95 ℃预变性 3 min35 个循环95 ℃变性 15 s57 ℃退火 15 s72 ℃延伸 2 min 30 s。PCR 产物纯化后加入 DpnI 于 37 ℃酶切 1 h降解原始模板质粒。酶切产物经 Gibson 组装50 ℃20 min后转化大肠杆菌 DH5α。挑取阳性转化子提取质粒测序验证再将正确质粒转化 IMX581 酵母菌株。2.6 全细胞催化挑取酿酒酵母单菌落接种于 2.5 mL YPD 培养基30 ℃、220 rpm 过夜培养制备种子液。按 1% 接种量转接至含有 50 mL YPD 培养基的 250 mL 摇瓶。分别培养 48 h、120 h 后发酵液 1500 × g 离心 5 min浓缩菌体至 OD₆₀₀≈50。菌体用 2 mL pH 7.0 磷酸盐缓冲液PBS重悬加入 1 mM 抗坏血酸、0.5 mM Fe²⁺、2 mM α-酮戊二酸以及底物400 mg/L 柚皮素或 200 mg/L 圣草酚30 ℃、220 rpm 振荡孵育 24 h。2.7 分析检测方法检测发酵液中柚皮素、二氢山奈酚、圣草酚与二氢槲皮素的含量取等体积甲醇与发酵液混匀萃取代谢物 5 min13500 × g 离心 5 min上清液经 0.22 μm 滤膜过滤。采用岛津高效液相色谱系统色谱柱为 Hypers11 ODS C18赛默飞流速 1.0 mL/min梯度洗脱方案参照文献 (8)流动相 A 为含 0.1%v/v三氟乙酸的乙腈流动相 B 为含 0.1%v/v三氟乙酸的水09 minA 相 10%40%919 minA 相 40%60%1921 minA 相 60%10%2124 minA 相维持 10%。二极管阵列检测器检测波长设置为 290 nm。3 结果与讨论3.1 酿酒酵母类黄酮合成通路的构建优化由柚皮素合成二氢槲皮素存在两条路径分别经过圣草酚或二氢山奈酚中间体完成转化图 1A。本研究首先探究柚皮素向二氢山奈酚的转化过程。黄烷酮3羟化酶F3H是类黄酮生物合成的关键酶负责 C3 位羟基化修饰(33)。已有研究表明草莓 FaF3H 与苹果 MdF3H 均可催化柚皮素生成二氢山奈酚也可催化圣草酚生成二氢槲皮素(12)。不同植物来源的酶存在底物特异性与催化活性差异因此本研究选用 FaF3H 与 MdF3H分别构建低拷贝、高拷贝过表达质粒转入 P001 菌株。以 200 mg/L 柚皮素为底物发酵 96 h低拷贝质粒过表达 FaF3H二氢山奈酚产量为 127.07 ± 1.98 mg/LMdF3H 组产量为 122.28 ± 5.70 mg/L。高拷贝质粒过表达条件下FaF3H、MdF3H 对应的二氢山奈酚产量分别为 98.67 ± 9.26 mg/L、111.34 ± 4.01 mg/L图 1B。两种酶合成二氢山奈酚的能力接近因此均被用于二氢槲皮素通路构建进一步评价二者催化性能。图 1 不同酶来源与表达模式对产物合成的影响(A) 酿酒酵母中二氢槲皮素DHQ的生物合成途径(B) 不同 F3H 酶及基因拷贝数对柚皮素NAR合成二氢山奈酚DHK的影响(C) 不同 CPR 酶及基因拷贝数对柚皮素合成圣草酚ERI的影响(D) 关键酶基因整合至酵母 X3 染色体位点的菌株以柚皮素为底物合成二氢槲皮素的结果。培养基中底物柚皮素添加浓度为 200 mg/L。P0P001/p416GPDP2P001/p426GPDI0IMX581。ERI圣草酚DHK二氢山奈酚DHQ二氢槲皮素2OGα酮戊二酸F3H黄烷酮3羟化酶F3′H类黄酮3′羟化酶CPR细胞色素 P450 还原酶。接下来利用非洲菊来源的 F3′HGhF3′H实现柚皮素向圣草酚、二氢山奈酚向二氢槲皮素的转化。该酶属于细胞色素 P450 酶需要细胞色素 P450 还原酶CPR这类氧化还原伴侣完成电子传递。已有研究证实优化 F3′H 及其氧化还原伴侣能够组装活性更高的酶复合体提升底物转化率与产物得率(9,34)。本研究首先在低拷贝质粒 p416GPD 上将水飞蓟 SmCPR、拟南芥 AtCPR 分别与 GhF3′H 进行游离质粒共表达。以 200 mg/L 柚皮素为底物GhF3′H 与 SmCPR 共表达菌株的圣草酚滴度更高可达 178.40 ± 8.08 mg/L。在微生物中提升外源基因表达水平通常是提高目标化合物产量的常用手段多拷贝质粒是酿酒酵母基因表达的常用策略。但将上述同一基因组合转入高拷贝质粒后圣草酚滴度反而下降至 46.05 mg/L图 1C。2μm 质粒的拷贝数会受异源表达基因的影响发生显著波动(35)。本实验中p426GPD 高拷贝质粒表达 F3′HCPR 组合后产量明显下降推测是 SmCPR 过表达消耗大量细胞资源造成合成能力下降。本实验中无论单独表达 F3H还是 F3′H 与 CPR 共表达低拷贝质粒均可获得更高产物滴度。综合产量与细胞资源消耗后续实验选用低拷贝质粒 p416GPD 表达异源酶。将用于柚皮素合成二氢槲皮素的重组质粒 p416DHQ 分别转入 B184MTU 与 P001 菌株。B184MTU 是 CEN.PK 5301C 经紫外诱变得到的突变株具备较强的蛋白分泌能力(36)P001 由代谢工程常用酵母底盘 CENPK 21C 敲除GAL80基因获得。本部分旨在探究不同菌株背景对二氢槲皮素合成的影响。两种底盘菌株均可合成二氢槲皮素其中 MdF3H、GhF3′H、SmCPR 组合在 PPQM 菌株中产量最高二氢槲皮素滴度达到 133.50 ± 3.16 mg/L附图 S1。但在营养丰富的 YPD 培养基中质粒遗传稳定性较差选择压力消失后细胞分裂过程中质粒容易丢失。为保障基因稳定表达需要将目的基因整合到染色体上。IMX581 菌株自带 CRISPR/Cas9 系统非常适合基因整合操作(31)。借助 CRISPR 系统将 FaF3H/MdF3H、GhF3′H、SmCPR 的表达片段无缝整合至 IMX581 菌株得到 IDXQM 工程菌株。携带 MdF3H、GhF3′H、SmCPR 的 IDXQM 菌株以 200 mg/L 柚皮素为底物可合成 130.88 ± 4.57 mg/L 二氢槲皮素同时积累 67.27 ± 4.23 mg/L 圣草酚、1.32 ± 0.32 mg/L 二氢山奈酚产量与游离质粒表达体系基本相当图 1D。F3′H 与 F3H 对不同底物催化效率存在差异具有明显的底物偏好性(37)。两株菌株均大量积累圣草酚说明 GhF3′H 更偏好柚皮素而非二氢山奈酚柚皮素向圣草酚转化效率高但圣草酚进一步转化为二氢槲皮素的效率偏低。因此后续实验重点提升 F3H 的酶活与表达水平以此突破该代谢瓶颈。3.2 基于分子对接分析筛选突变位点为解析 MdF3H 的结构-功能关系提高其对目标底物的催化效率采用计算机辅助蛋白设计策略。通过分子对接预测底物 α-酮戊二酸2OG、圣草酚ERI在 MdF3H 催化口袋中的结合状态。MdF3H 预测结构具备典型的双链 β螺旋折叠图 2A。蛋白表面静电势图显示活性空腔结合 α酮戊二酸与亚铁离子Fe²⁺维持蛋白结构稳定圣草酚结合在疏水溶剂通道内便于发生羟基化反应图 2B。亚铁辅因子由保守的 2His1AspHxDxnH三联体氨基酸配位结合图 2C。与其他 α酮戊二酸依赖型双加氧酶一致保守 RxS 氨基酸基序与 α酮戊二酸辅底物的 C1 羧基、C2 羰基形成氢键(3840)。以受体蛋白与对接后的圣草酚分子分析双辅底物2OG、Fe²⁺共同参与的复合物结合模式。分子对接结果显示圣草酚 7 位羟基与 K216 形成氢键4′位羟基与 N294 形成氢键图 2D。基于对接结果将一批候选氨基酸残基突变为丙氨酸评估突变对酶活性的影响。候选位点包括与 2OG、Fe²⁺形成氢键的残基Asn201、His218、Asp220与圣草酚形成氢键的残基Lys216、Asn294参与圣草酚疏水相互作用的残基Leu120、Arg129、Lys197、Val199、Leu215、Pro221、Phe292、Asn294、Tyr320、Tyr324。图 2 MdF3H 的同源建模、分子对接与定点突变(A) MdF3H 预测结构对接结合 α酮戊二酸、Fe²⁺与 (2S)柚皮素(B) 蛋白表面静电势示意图(C)α酮戊二酸与 Fe²⁺的结合位点(D) 柚皮素附近筛选得到的突变位点(E) 各突变体的二氢槲皮素转化率与相对产量。培养基底物柚皮素添加浓度为 200 mg/L。对照组IMXPM。通过全质粒 PCR 扩增构建 L120A、R129A、K197A、H199A、N201A、L215A、K216A、H218A、D220A、P221A、F292A、N294A、Y320A 与 Y324A 突变体。通过发酵实验检测各突变体与野生型 MdF3H 的催化能力。野生型 MdF3H 催化圣草酚转化为二氢槲皮素的转化率为 59.52 ± 7.27%图 2E。将 α酮戊二酸与 Fe²⁺结合位点R129、N201、H218、D220突变为丙氨酸后酶催化活性完全丧失该结果与已发表报道一致(41)。此外大部分突变体L120A、K197A、K216A、F292A、Y320A、Y324A活性出现不同程度下降其中 K197A 完全丧失羟基化活性。推测这些氨基酸通过氢键在 α酮戊二酸铁反应中心稳定底物促进自由基羟基化反应突变后该功能被破坏。另有文献报道将 K197 替换为碱性氨基酸可恢复 K197A 的催化活性说明碱性氨基酸可作为质子受体稳定底物过渡态进而介导羟基化反应(42)。 值得注意的是P221A 突变体二氢槲皮素转化活性提升转化率达到 75.10 ± 4.96%为野生型 MdF3H 的 1.26 倍图 2E。随后对 221 位脯氨酸开展饱和突变探究不同氨基酸残基对终产物合成的影响。以 800 mg/L 柚皮素为底物不含磷酸钠缓冲体系的 YPD 培养基发酵 144 h结果显示脯氨酸突变为丙氨酸效果最优。脯氨酸突变为丙氨酸可减弱 R构型底物与活性中心的相互作用推测空间位阻降低使黄烷酮的羟基化过程更加灵活但该假说尚未得到验证。尽管缺少直接实验证据P221A 仍是极具应用潜力的有效突变位点。3.3 柚皮素合成二氢槲皮素的生物合成通路优化为评估 P221A 突变对柚皮素合成二氢槲皮素的影响在 IDXQM 菌株中过表达突变体 MdF3HP221A。该突变能够显著促进积累的圣草酚向二氢槲皮素转化附图 S2。在营养丰富的 YPD 培养基中细胞分裂过程缺少筛选压力质粒丢失风险升高(43)。同时启动子强度差异、胞内资源受限、环境胁迫以及 pH 波动均会削弱 F3H 催化性能(37)。为保障基因遗传稳定性将目的基因整合至染色体中性位点。为进一步提高二氢槲皮素产量选用两种不同强度启动子强启动子 TDH1p、中等强度启动子 PDC1p表达 P221A 突变体将 MdF3HP221AGhF3′HSmCPR 表达盒整合至 X3 染色体位点图 3A得到 IDXQ221AT 与 IDXQ221AP 菌株。对照组 IDXQM 使用 PDC1p 启动子表达野生型 MdF3H图 3A。底物 800 mg/L 柚皮素发酵延长至 168 hIDXQ221AT 菌株二氢槲皮素最高滴度可达 516.84 ± 2.83 mg/L是对照组的 1.67 倍图 3B。IDXQ221AP 菌株产量同样提升二氢槲皮素滴度 477.23 ± 8.22 mg/L为对照组的 1.54 倍。将柚皮素底物浓度提升至 1 g/L二氢槲皮素产量没有明显提高但出现二氢山奈酚积累附图 S3。推测高浓度柚皮素改变 F3′H 与 F3H 之间的底物竞争关系更利于 F3H 催化柚皮素生成二氢山奈酚(8)。延长发酵时间可以促进柚皮素向二氢槲皮素转化但圣草酚依旧大量积累。为判断圣草酚是否滞留在 F3′H 酶的催化口袋无法与 F3H 发生底物交换本研究分析胞外与胞内产物分布。结果表明绝大部分圣草酚被转运至胞外图 4A说明圣草酚不会大量滞留于胞内 F3′H 酶中。由此推测发酵过程中 F3H 酶降解限制了圣草酚向二氢槲皮素的转化。图 3 通过 MdF3H 突变提升二氢槲皮素产量(A) 菌株构建背景(B) 不同发酵时长条件下野生型 MdF3H 及其突变酶对 800 mg/L 柚皮素合成二氢槲皮素的影响。对照组IDXQM221APIDXQ221AP221ATIDXQ221AT。图 4 不同发酵时间下通过全细胞催化评估 MdF3H 与 MdF3HP221A的酶活(A) 以 800 mg/L 柚皮素为底物时胞内、胞外代谢物含量分布(B) 实验流程示意图由BioRender.com绘制(C) 培养 48 h 的酵母菌体开展全细胞催化(D) 培养 120 h 的酵母菌体开展全细胞催化。In胞内Ex胞外。对照组IDXQM221APIDXQ221AP。NAR 组添加 400 mg/L 柚皮素ERI 组添加 200 mg/L 圣草酚。3.4 培养基优化提升二氢槲皮素产量为探究发酵过程中 MdF3H 是否存在酶降解现象将 IDXQ221AP 与 IDXQM 菌株分别在 YPD 培养基中培养 48 h 和 120 h离心收集菌体并重悬于缓冲液加入 400 mg/L 柚皮素与 200 mg/L 圣草酚作为底物在 F3H 酶最适反应条件下开展全细胞催化实验图 4B。 结果显示采用培养 48 h 的菌体进行全细胞催化时IDXQM 与 IDXQ221AP 两株菌株底物利用能力相近图 4C。但培养 120 h 的菌体中IDXQM 菌株合成二氢槲皮素的效率显著下降而 IDXQ221AP 菌株对不同底物仍可维持较好催化性能图 4D。该结果说明野生型 MdF3H 在发酵后期逐步发生降解或失活导致圣草酚向二氢槲皮素的转化受阻与之相比P221A 突变体对发酵过程中的环境变化适应性更强。因此延长发酵时间可以进一步提升 P221A 突变体将柚皮素转化为二氢槲皮素的效率。酵母呼吸代谢产生有机酸发酵结束后培养基 pH 会下降至 4.34(17)酸性环境会抑制 MdF3H 的催化活性。为维持发酵全程 F3H 的最佳酶活使用十二水磷酸氢二钠与二水磷酸二氢钠将培养基 pH 调至 6.0。同时添加 F3H 催化所必需的 Fe²⁺与 α酮戊二酸评估二者对二氢槲皮素合成的影响。发酵总时长设置为 168 h结果显示 144 h 之后转化率不再显著提升因此确定 144 h 为最优发酵时长图 5A。 YPD 培养基中补充磷酸盐可以稳定体系 pHIDXQ221AP、IDXQM 菌株的二氢槲皮素产量分别达到 545.61 mg/L、566.50 mg/L。在此基础上额外添加 Fe²⁺后IDXQ221AP 菌株柚皮素到二氢槲皮素的底物转化率最高可达 71.26%图 5B。而外源添加 α酮戊二酸并不能明显提高二氢槲皮素滴度附图 S5说明 YPD 培养基营养充足细胞自身合成的 α酮戊二酸已可满足需求无需额外补加。为缓解实验条件下中间体圣草酚的积累在最优发酵条件下尝试通过质粒表达p416p221A或者基因组多拷贝整合的方式提高 F3H 基因拷贝数以期强化圣草酚向二氢槲皮素的转化。但提高 F3H 拷贝数并未显著促进圣草酚转化反而造成二氢山奈酚少量积累附图 S6提示在本体系中 F3H 基因拷贝数并不是主要限制因素。后续研究可以引入转运蛋白进一步降低圣草酚的积累。 本研究证实酿酒酵母可以高效表达植物来源 P450 酶用于合成羟基化类黄酮通过培养基组分优化成功提升酵母合成二氢槲皮素的生产能力。图 5 不同培养基条件对 800 mg/L 柚皮素合成二氢槲皮素的影响(A) IDXQ221AP 菌株在不同发酵时长下的转化率变化(B) 发酵 144 h 后的发酵结果。对照组IDXQM221APIDXQ221AP。Fe²⁺0.5 mM 亚铁离子2OG1 mM α酮戊二酸。