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做差异表达分析的科研人员大概都遇到过这样的情况:一个你高度怀疑与疾病相关的基因做出来p值却不显著。是这个基因真的和疾病无关还是分析方法本身出了问题?近期发表于《Communications Biology》IF 5.8 中科院一区的一项研究将PacBio Kinnex长读长测序与10x单细胞前处理联用在同一批脑组织样本中同时开展基因层面与转录本层面的表达分析结果发现SEPTIN4和CHI3L1这两个基因恰好演示了同一种现象的两种版本——一升一降互相抵消与基因升高实为一个新亚型在升高。这为理解为什么基因层面无变化不能简单等同于与疾病无关提供了一个实证案例。01 现象是怎么被发现的:一份cDNA两套账要理解互相抵消是怎么发生的得先看研究团队是怎么设计实验的。同一批单细胞核barcoded cDNA文库被一分为二一份片段化后做Illumina短读长测序只能测到基因的一段序列靠计数落在某个基因上的reads总数来估算基因整体表达量另一份不片段化直接用PacBio Kinnex长读长测序可以读出每一条完整的转录本精确到这个基因的第几种剪接形式表达了多少。两种测序用的是同一份样本、同一套细胞条形码因此可以在同一个坐标系里直接比较基因层面和转录本层面到底看到了什么——而不用担心是样本差异导致的结果不一致。实验流程图原文fig1a02 SEPTIN4——一升一降刚好在基因层面消失SEPTIN4编码一种GTP结合的细胞骨架蛋白参与神经元结构与突触功能并且已在帕金森病和AD患者脑内的病理性蛋白聚集体中被检测到——从功能上看这是一个非常值得关注的AD候选基因。但如果只做短读长基因层面分析SEPTIN4并不会出现在任何一个细胞类型的DEG列表里。长读长数据揭示了原因。Figure 5a的火山图中SEPTIN4的两个转录本被标记为同一个‡符号成对出现:一个已知的FSM(全长匹配)转录本(ENST00000317256.10)在AD中显著下调同时被DEXseq鉴定为显著switch;一个此前未被注释的NIC(新剪接体)转录本(PB.73144第2外显子部分缺失)在AD中显著上调。原文fig5aFigure 5b用堆积柱状图直观展示了这个switch:在AD样本中ENST00000317256.10(浅蓝色)占该基因全部reads的比例明显低于ND样本而其余isoform(包括上调的NIC转录本)占比相应升高——柱子颜色构成的比例在AD和ND之间发生了肉眼可见的翻转。原文fig5bFigure 6a-c进一步给出了结构示意图与实验验证:两个转录本的外显子结构图清楚显示了NIC转录本在第2外显子处的缺失区域RT-PCR凝胶电泳(在全部16例AD/ND样本中)确认了两条转录本都是真实存在、可重复检测到的产物而不是测序或分析流程中的技术假象。原文fig6a-c这就是互相抵消的完整机制:一个亚型在减少另一个亚型在增加两者变化方向相反、幅度相当加总到基因总表达量这一个数字时涨跌相互抵消短读长分析看到的自然就是无显著差异。03 CHI3L1——基因层面升高其实是一个新亚型在升高如果说SEPTIN4展示的是真实信号被抵消到看不见那么CHI3L1展示的是另一种更容易被误读的情况——基因层面确实检测到了显著变化但这个变化的来源被完全误判了。CHI3L1编码YKL-40蛋白是脑脊液中经典的神经炎症生物标志物其水平已被证实与AD病情严重程度和认知衰退程度正相关。Figure 6f的热图显示短读长基因层面分析确认CHI3L1在AD星形胶质细胞中显著上调(标注了星号)——单看这一步结论似乎已经很清楚:AD中星形胶质细胞的CHI3L1表达升高了。原文fig6f但长读长数据(Figure 6d e)显示该基因在样本中共检测到三种转录本:一个已知FSM转录本(ENST00000255409.8)、一个新发现的NIC转录本(PB.178972含两个内含子保留)、以及一个低丰度的NNC转录本(PB.178974)。Figure 5a的火山图和Figure 6h的RT-qPCR定量结果共同证实:已知的FSM转录本在AD和ND之间表达水平没有显著差异(RT-qPCR:p 0.0721不显著);新发现的NIC转录本(PB.178972)才是真正在AD中显著上调的那一个(RT-qPCR:p 0.0289)。原文fig6d-h换句话说基因层面看到的CHI3L1升高几乎完全是由这一个此前未被注释的新剪接体贡献的而教科书里熟悉的标准版CHI3L1其实纹丝不动。如果只做基因层面分析研究者很可能会想当然地把这个升高信号归因于经典YKL-40通路而实际驱动疾病相关变化的是一个全新的、结构上带有内含子保留的转录本。04 这不是巧合而是细胞类型特异性的必然结果Figure 9a把全部差异表达转录本(DET)按细胞类型画成了一张比例热图进一步说明了为什么基因层面容易漏掉这类信号:CHI3L1的两个新亚型(PB.178972、PB.178974)几乎只在星形胶质细胞中被检出而SEPTIN4的上调新亚型(PB.73144)几乎只在少突胶质细胞中被检出。原文fig9a也就是说这些救命的关键亚型信号原本就高度集中在特定细胞类型里表达模式本身就很局部。当短读长分析把reads计数简单加总到基因层面时不仅不同isoform之间的方向差异会被抹平不同细胞类型之间的表达差异也会被进一步稀释——两层平均化叠加在一起像SEPTIN4和CHI3L1这样的信号想在基因层面被看见几率本来就不高。05总结这项研究用SEPTIN4和CHI3L1两个案例清楚地展示了基因层面无差异这个结论背后可能藏着的两种陷阱:要么是两个方向相反的亚型互相抵消真实信号被隐藏;要么是基因层面看到的变化实际上完全由一个此前未被注释的新亚型驱动而被默认关联的标准转录本本身毫无变化。这两种情况在传统短读长单细胞转录组分析中都无法被区分只有借助长读长测序获得全长isoform信息才能把基因这个笼统单位拆解成一个个具体的、可能有着完全不同命运的转录本。对于阿尔茨海默病这类分子机制复杂、异质性强的疾病而言isoform分辨率或许正是理解那些看似平静的基因背后真实故事的关键钥匙。瑞兴生物三代测序与单细胞三代测序技术服务可精准解析全长转录本、新剪接体与isoform switching等短读长测序难以触及的关键信号依托研究设计—测序服务—数据挖掘—验证实验的一站式服务体系助力科研人员从基因层面深入到转录本分辨率挖掘被传统方法掩盖的关键分子机制加速产出经得起同行审阅、具有转化价值的高质量研究成果。(欢迎咨询了解更多三代测序与单细胞三代测序解决方案)参考文献Shahnaee A. Liu C.S. Ngo T. et al. RNA isoform diversity splicing variants and switching in single cells of the Alzheimers disease brain.Commun Biol9 506 (2026).数据资源:European Genome-Phenome Archive (EGA)accession EGAS50000001476 一个基因两个亚型，一升一降如何在阿尔茨海默病中“互相抵消“? 揭示短读长测序“看不见“的信号
做差异表达分析的科研人员大概都遇到过这样的情况:一个你高度怀疑与疾病相关的基因做出来p值却不显著。是这个基因真的和疾病无关还是分析方法本身出了问题?近期发表于《Communications Biology》IF 5.8 中科院一区的一项研究将PacBio Kinnex长读长测序与10x单细胞前处理联用在同一批脑组织样本中同时开展基因层面与转录本层面的表达分析结果发现SEPTIN4和CHI3L1这两个基因恰好演示了同一种现象的两种版本——一升一降互相抵消与基因升高实为一个新亚型在升高。这为理解为什么基因层面无变化不能简单等同于与疾病无关提供了一个实证案例。01 现象是怎么被发现的:一份cDNA两套账要理解互相抵消是怎么发生的得先看研究团队是怎么设计实验的。同一批单细胞核barcoded cDNA文库被一分为二一份片段化后做Illumina短读长测序只能测到基因的一段序列靠计数落在某个基因上的reads总数来估算基因整体表达量另一份不片段化直接用PacBio Kinnex长读长测序可以读出每一条完整的转录本精确到这个基因的第几种剪接形式表达了多少。两种测序用的是同一份样本、同一套细胞条形码因此可以在同一个坐标系里直接比较基因层面和转录本层面到底看到了什么——而不用担心是样本差异导致的结果不一致。实验流程图原文fig1a02 SEPTIN4——一升一降刚好在基因层面消失SEPTIN4编码一种GTP结合的细胞骨架蛋白参与神经元结构与突触功能并且已在帕金森病和AD患者脑内的病理性蛋白聚集体中被检测到——从功能上看这是一个非常值得关注的AD候选基因。但如果只做短读长基因层面分析SEPTIN4并不会出现在任何一个细胞类型的DEG列表里。长读长数据揭示了原因。Figure 5a的火山图中SEPTIN4的两个转录本被标记为同一个‡符号成对出现:一个已知的FSM(全长匹配)转录本(ENST00000317256.10)在AD中显著下调同时被DEXseq鉴定为显著switch;一个此前未被注释的NIC(新剪接体)转录本(PB.73144第2外显子部分缺失)在AD中显著上调。原文fig5aFigure 5b用堆积柱状图直观展示了这个switch:在AD样本中ENST00000317256.10(浅蓝色)占该基因全部reads的比例明显低于ND样本而其余isoform(包括上调的NIC转录本)占比相应升高——柱子颜色构成的比例在AD和ND之间发生了肉眼可见的翻转。原文fig5bFigure 6a-c进一步给出了结构示意图与实验验证:两个转录本的外显子结构图清楚显示了NIC转录本在第2外显子处的缺失区域RT-PCR凝胶电泳(在全部16例AD/ND样本中)确认了两条转录本都是真实存在、可重复检测到的产物而不是测序或分析流程中的技术假象。原文fig6a-c这就是互相抵消的完整机制:一个亚型在减少另一个亚型在增加两者变化方向相反、幅度相当加总到基因总表达量这一个数字时涨跌相互抵消短读长分析看到的自然就是无显著差异。03 CHI3L1——基因层面升高其实是一个新亚型在升高如果说SEPTIN4展示的是真实信号被抵消到看不见那么CHI3L1展示的是另一种更容易被误读的情况——基因层面确实检测到了显著变化但这个变化的来源被完全误判了。CHI3L1编码YKL-40蛋白是脑脊液中经典的神经炎症生物标志物其水平已被证实与AD病情严重程度和认知衰退程度正相关。Figure 6f的热图显示短读长基因层面分析确认CHI3L1在AD星形胶质细胞中显著上调(标注了星号)——单看这一步结论似乎已经很清楚:AD中星形胶质细胞的CHI3L1表达升高了。原文fig6f但长读长数据(Figure 6d e)显示该基因在样本中共检测到三种转录本:一个已知FSM转录本(ENST00000255409.8)、一个新发现的NIC转录本(PB.178972含两个内含子保留)、以及一个低丰度的NNC转录本(PB.178974)。Figure 5a的火山图和Figure 6h的RT-qPCR定量结果共同证实:已知的FSM转录本在AD和ND之间表达水平没有显著差异(RT-qPCR:p 0.0721不显著);新发现的NIC转录本(PB.178972)才是真正在AD中显著上调的那一个(RT-qPCR:p 0.0289)。原文fig6d-h换句话说基因层面看到的CHI3L1升高几乎完全是由这一个此前未被注释的新剪接体贡献的而教科书里熟悉的标准版CHI3L1其实纹丝不动。如果只做基因层面分析研究者很可能会想当然地把这个升高信号归因于经典YKL-40通路而实际驱动疾病相关变化的是一个全新的、结构上带有内含子保留的转录本。04 这不是巧合而是细胞类型特异性的必然结果Figure 9a把全部差异表达转录本(DET)按细胞类型画成了一张比例热图进一步说明了为什么基因层面容易漏掉这类信号:CHI3L1的两个新亚型(PB.178972、PB.178974)几乎只在星形胶质细胞中被检出而SEPTIN4的上调新亚型(PB.73144)几乎只在少突胶质细胞中被检出。原文fig9a也就是说这些救命的关键亚型信号原本就高度集中在特定细胞类型里表达模式本身就很局部。当短读长分析把reads计数简单加总到基因层面时不仅不同isoform之间的方向差异会被抹平不同细胞类型之间的表达差异也会被进一步稀释——两层平均化叠加在一起像SEPTIN4和CHI3L1这样的信号想在基因层面被看见几率本来就不高。05总结这项研究用SEPTIN4和CHI3L1两个案例清楚地展示了基因层面无差异这个结论背后可能藏着的两种陷阱:要么是两个方向相反的亚型互相抵消真实信号被隐藏;要么是基因层面看到的变化实际上完全由一个此前未被注释的新亚型驱动而被默认关联的标准转录本本身毫无变化。这两种情况在传统短读长单细胞转录组分析中都无法被区分只有借助长读长测序获得全长isoform信息才能把基因这个笼统单位拆解成一个个具体的、可能有着完全不同命运的转录本。对于阿尔茨海默病这类分子机制复杂、异质性强的疾病而言isoform分辨率或许正是理解那些看似平静的基因背后真实故事的关键钥匙。瑞兴生物三代测序与单细胞三代测序技术服务可精准解析全长转录本、新剪接体与isoform switching等短读长测序难以触及的关键信号依托研究设计—测序服务—数据挖掘—验证实验的一站式服务体系助力科研人员从基因层面深入到转录本分辨率挖掘被传统方法掩盖的关键分子机制加速产出经得起同行审阅、具有转化价值的高质量研究成果。(欢迎咨询了解更多三代测序与单细胞三代测序解决方案)参考文献Shahnaee A. Liu C.S. Ngo T. et al. RNA isoform diversity splicing variants and switching in single cells of the Alzheimers disease brain.Commun Biol9 506 (2026).数据资源:European Genome-Phenome Archive (EGA)accession EGAS50000001476