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如果 CDR 是抗原结合的核心区域那么保留 CDR为什么不能保证保留亲和力这是很多人第一次接触抗体人源化时最容易困惑的问题。从直觉上看CDR 是抗体识别抗原的核心。我们把鼠源抗体中最重要的 CDR 保留下来再把框架区换成人源似乎就应该既降低非人源风险又保留原来的抗原识别能力。但真实项目经常不会这么顺利。一条人源化候选序列CDR 完全保留人源化评分也提高了整体结构模型看起来没有明显问题可是 BLI 或 SPR 一测亲和力掉了 10 倍、20 倍甚至更多。再往下拆可能是解离变快也可能是结合变慢可能是细胞结合变弱也可能是阻断、激活或内吞功能直接掉下去。这个时候问题往往不是 CDR 序列有没有保留。问题是CDR 换到新的框架区以后原来的抗原结合几何关系还在不在。前面《人源化第一性原理》部分我们已经讲过三件事第一人源化不是简单把鼠源抗体改得更像人而是在降低非人源可变区风险的同时保住一个已经被实验验证过的抗体表型。第二鼠抗、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体不是从落后到先进的等级表而是不同研发处境下的工程选择。第三人源化评分、人源性评分和天然性评分都只是参考指标。它们可以帮助我们理解一条序列像不像人抗体但不能替代亲和力、功能、结构和可开发性验证。从这一篇开始我们进入Framework 工程学。它要回答的不是“框架区是什么”而是一个更真实的问题为什么很多抗体在人源化时明明保留了 CDR结合和功能还是会下降这篇文章先讲清楚什么这一篇不急着讨论所有 FR 位点怎么改也不急着给 back mutation 清单。我们先把底层逻辑讲清楚。第一CDR grafting 为什么一开始是合理的第二为什么 CDR 不能被理解成可以复制粘贴的模块第三Vernier Zone 为什么重要第四项目中如何理性识别高风险 FR 位点在进入今天的内容前先了解一下这几个术语。互补决定区Complementarity determining regionCDR抗体可变区中最主要参与抗原识别的高变区域。通常六条 CDR 共同形成抗体结合抗原的核心表面。框架区FrameworkFRCDR 之外的可变区结构区域。它不只是支架还会影响 CDR 环区构象、重链/轻链取向、局部堆积和抗体稳定性。CDR 移植CDR grafting经典人源化方法之一。基本思路是保留鼠源抗体 CDR将其移植到人源框架区上以减少非人源框架成分同时尽量保留原有抗原识别能力。抗原结合表面Paratope抗体上参与抗原识别的三维表面。它不等于 CDR 序列本身而是由 CDR、部分框架区残基、重链/轻链空间关系共同形成。Vernier 位点Vernier residues通常位于 CDR 下方或邻近区域的框架区残基。它们未必直接接触抗原却可能通过支撑 CDR、调节局部堆积和改变环区位置影响结合。重链/轻链取向VH/VL orientation抗体重链可变区和轻链可变区之间的相对空间关系。它决定六条 CDR 如何共同组成抗原结合表面。回复突变Back mutation在人源化候选中选择性恢复部分亲本鼠源框架区残基。它不是简单“改回去”而是为了恢复关键结构支撑或功能表型。Kabat、Chothia、IMGT 编号抗体可变区常见的编号系统。不同的系统在CDR边界定义和残基命名上略有差异因此在讨论FR、CDR或Vernier残基时必须明确使用哪种编号系统。CDR 移植为什么一开始看起来合理先说 CDR grafting 为什么成立。抗体可变区由 CDR 和 FR 组成。CDR 通常位于抗体可变区顶部是参与抗原识别最集中的区域。很多直接接触抗原的残基确实位于 CDR 中。因此如果一条鼠源抗体已经证明能结合某个靶点甚至已经在细胞实验中看到了明确功能那么保留它的 CDR是一个非常自然的工程先验。这也是经典 CDR 移植的出发点。Jones 等人在 1986 年 Nature 文章中把鼠源抗体 B1-8 重链可变区的 CDR 替换到人源骨髓瘤蛋白对应位置并观察到新抗体在与 B1-8 鼠源轻链组合时获得了 B1-8 对半抗原 NP-cap 的亲和力。这篇文章提出替换 CDR 可能成为从鼠源单抗构建人源化抗体的一种路线。这项工作的意义不是证明“只要保留 CDR 就一定成功”。它真正打开的是一个思路如果亲本抗体的抗原识别信息主要集中在 CDR那么 CDR 移植可以作为减少非人源框架区、同时尝试保留抗原识别能力的合理起点。后来的 Riechmann 等人在 1988 年 Nature 文章中将大鼠抗体的六条高变区引入人源抗体框架用于构建用于治疗方向的 reshaped human antibody。这也是早期人源化抗体路线中非常重要的工作。Queen 等人在 1989 年报道了针对人 IL-2 receptor p55 链的 humanized anti-Tac antibody也是早期人源化抗体工程的重要案例。这些工作共同说明了一件事保留 CDR 是合理起点但不是成功保证。因为 CDR 移植有一个隐含前提CDR 放到新的框架区以后还能保持原来的构象和相对位置。这恰恰是人源化最难的地方。CDR 不是可以复制粘贴的模块在 CDR 移植时会有一个误区既然 CDR 是主要结合区域那我把 CDR 保留下来不就保留结合能力了吗这个理解只对了一半。CDR 确实是抗原识别的核心区域但 CDR 不是悬浮在空气里的六条环。它们坐在框架区上受到框架区的支撑、约束和调节。有些框架区残基像地基从 CDR 下方托住环区有些影响重链和轻链的相对角度有些参与 β 折叠片层的内部堆积有些改变局部氢键网络还有一些靠近 CDR 的框架区残基甚至可能直接参与抗原接触。所以CDR grafting 的正确理解不是“复制 CDR”。更准确的说法是把一个已经验证过的抗原结合表面迁移到新的框架区环境中。这句话里最关键的是“环境”。同一条 CDR 序列在不同框架区上可能不是同一个结构状态。CDR 环区的高度可能变一点环区底部可能松一点某个芳香侧链可能换一个方向原来的氢键网络可能断开原来指向抗原的带电残基可能因为局部环境改变而重新取向。这些变化单独看都不大。但抗体结合本来就依赖局部几何。一个侧链转一点一个环区底部松一点一个口袋开口变一点最后都可能体现在解离变快、结合变慢、细胞结合下降或者功能实验里活性丢失。这也是 canonical structure 理论对人源化的提醒。Chothia 和 Lesk 在 1987 年提出抗体高变区 canonical structures 的概念指出许多高变区环的主链构象可以归入有限的结构类型并与环长、关键残基和部分框架区位置有关。后续 Chothia 等人在 1989 年 Nature 文章中进一步讨论了免疫球蛋白高变区构象与关键位点之间的关系。这给人源化一个重要提醒CDR 环区构象不是只由 CDR 序列自己决定。如果人源框架区不能提供原来鼠源框架区中的那组结构支撑即使 CDR 序列完全一样CDR 也可能以另一种方式呈现。而抗原识别依赖的不是 CDR 字符串。它依赖的是整个抗原结合表面的三维几何关系。Vernier Zone 到底是什么理解这一点以后Vernier Zone 就不是一个孤立术语了。它是解释“CDR 没变为什么亲和力还会掉”的关键机制之一。Foote 和 Winter 在 1992 年 Journal of Molecular Biology 文章中系统讨论了抗体框架区残基如何影响高变区环的构象并提出 Vernier zone 的概念。他们强调一些框架区残基虽然不一定直接接触抗原却可能影响高变区环的构象在人源化或环区移植中对这些位置进行有依据的选择可能对成功移植非常关键。所谓 Vernier residues可以理解为位于 CDR 下方或邻近区域的一组框架区残基。它们不一定直接接触抗原。如果只看抗原-抗体接触界面它们可能不会出现在接触残基列表里。如果只看序列比对它们可能只是普通 FR 位点。如果只看人源化评分模型甚至可能鼓励你把这些鼠源残基改成人源残基。但从结构上看它们可能正在支撑 CDR。真正接触抗原的 CDR 环在上面而 Vernier 位点在下面调节它的高度、角度、堆积和稳定性。某个位点从大侧链换成小侧链可能让 CDR 下方出现空隙从疏水残基换成极性残基可能改变局部堆积从芳香残基换成脂肪族残基可能让原本的芳香堆积或疏水支撑消失一个氢键供体或受体变化也可能让环区底部的相互作用网络重新排列。于是表面上 CDR 没变。但 CDR 站的位置变了。这就是 Vernier Zone 对人源化的工程意义。它提醒我们框架区残基的重要性不能只靠“是否直接接触抗原”来判断。很多真正危险的 FR 突变可能藏在 CDR 下方不在界面上却支撑着界面。这也是下一篇会讲到 back mutation 的基础。Back mutation 不是倒退而是对关键结构条件的选择性恢复。CDR 没变亲和力为什么会掉现在可以把问题拆得更具体一些。CDR 序列没变亲和力下降常见原因不止一种。第一种是 Vernier 支撑改变。比如某个框架区残基原本位于 CDR-H3 或 CDR-L1 下方提供疏水支撑。人源化时这个位点被替换成更符合人源框架的残基。人源性提高了但侧链体积变小CDR 下方堆积变松。CDR 主链可能只移动了很小的距离可是关键侧链的方向已经发生改变。第二种是 CDR 侧链方向改变。这点特别容易被忽略。CDR 主链 RMSD 很小不代表 CDR 侧链没有变。一个 Tyr、Trp、Arg、Asp 或 Asn 的侧链方向变化可能直接影响抗原接触。原来这个残基指向抗原可以形成氢键、芳香堆积、盐桥或疏水接触换了框架区以后局部环境变了它仍然在 CDR 序列里但侧链方向变了不再以原来的方式接触抗原。这时如果只看序列会觉得它没变。如果只看主链 RMSD也可能觉得变化不大。但真正支持结合的接触已经变了。第三种是重链/轻链取向改变。抗体的抗原结合表面不是由重链或轻链单独决定而是由 VH 和 VL 共同组成。六条 CDR 不是孤立存在而是在重链/轻链配对后形成一个整体表面。如果框架区替换影响了 VH/VL 界面即使每条 CDR 自身变化不大六条 CDR 之间的相对位置也可能改变。原来形成口袋的重链和轻链残基可能开口变宽或变窄原来能同时接触抗原两个区域的侧链可能距离不再合适。它不是 CDR “丢了”。而是 CDR 之间的空间关系变了。第四种是局部氢键、盐桥和电荷网络改变。框架区和 CDR 之间可能存在局部氢键网络或盐桥。某个 FR 突变不直接接触抗原却可能改变环区底部稳定性改变关键侧链方向或者改变结合表面的电荷环境。这类变化可能影响解离速度也可能影响结合速度。如果复合物稳定性下降常常表现为解离变快。如果抗体在未结合状态下的预组织状态变差或者结合表面的电荷引导发生变化可能表现为结合变慢。第五种是结合前后的构象分布改变。亲和力不是静态结构截图。它背后是自由能差。人源化可能改变抗体在未结合状态下的构象分布。即使结合后模型看起来接近未结合状态下的环区柔性、预组织状态和诱导契合代价也可能已经变了。换句话说CDR 没变不代表结合过程没变。一个抗体能不能高效结合抗原不仅取决于结合后能形成什么接触也取决于结合前它是否已经以合适的构象准备好了。这就是为什么结构模型很重要但不能被简单使用。结构模型不是为了给我们一个 RMSD 数字。它更重要的作用是帮助我们提出机制假设。项目中怎么识别高风险 FR 位点这一部分很容易写成步骤清单但真实项目不是照着菜单走。更合理的做法是围绕一个核心问题展开哪些 FR 突变最可能解释实验表型的变化比如拿到一批人源化候选发现有些候选亲和力掉得很厉害有些候选还能保住功能。这个时候不应该先急着把所有结构指标都算一遍而是要把分析拆成三层。第一层先确定“改了什么”。也就是把亲本抗体和人源化候选放到同一个编号体系下明确 CDR 和 FR 的边界列出所有 FR 突变。这里需要说明使用 Kabat、Chothia、IMGT 还是 AHo 编号因为不同体系对 CDR 边界的定义并不完全一致。ANARCI 这类工具可以帮助完成抗体可变区编号并支持 Kabat、Chothia、IMGT、AHo 等常见编号体系。这一步的目的不是做一张突变表就结束。而是回答哪些位点从鼠源变成了人源哪些位点位于 CDR 附近哪些位点靠近重链/轻链界面哪些位点埋在结构内部哪些位点可能属于 Vernier 区域第二层再判断“这些变化可能影响什么”。这里就要进入结构。如果有亲本抗体或复合物的实验结构优先使用实验结构。如果没有可以使用 AF3、ABodyBuilder、RosettaAntibody、IgFold 等工具建立亲本和候选结构。关键不是迷信某一个模型而是尽量保证亲本和候选使用可比较的建模流程避免把工具差异误认为突变差异。结构比较时不要只看整体 RMSD。整体 RMSD 很小只能说明模型总体没有散。人源化真正要看的是局部关系有没有变。CDR 下方 4–6 Å 范围内的 FR 残基有没有变化CDR base 的堆积有没有变松Vernier 位点是否从大侧链变成小侧链芳香堆积是否消失局部氢键网络是否断开重链/轻链界面的相互作用是否改变关键 CDR 侧链是否还指向抗原4–6 Å 只是经验窗口不是机械标准。真正重要的是这些位点是否参与支撑、堆积、取向和界面形成。第三层最后把结构变化和实验表型对上。这是最容易被忽略的一步。如果某个候选 KD 掉了 20 倍要继续拆是结合变慢还是解离变快如果主要是解离变快那要重点看复合物界面接触是否丢失、CDR 侧链方向是否变化、Vernier 支撑是否让结合后状态不稳。如果主要是结合变慢那要重点看未结合状态的预组织、表面电荷引导、CDR 环区柔性和构象分布。如果细胞结合下降但纯蛋白亲和力变化不大就要考虑抗原在细胞膜上的构象、表位可及性、抗体结合角度和空间位阻。如果亲和力保住了但功能掉了就不能只盯着 KD。阻断抗体要看竞争关系激动抗体要看受体聚集方式内吞抗体要看结合后的细胞过程带 Fc 功能的抗体还要看效应功能。如果 binding 和 function 都还可以但 SEC、HIC 或 AC-SINS 出问题那说明风险可能不在抗原结合界面而在表面疏水斑块、电荷斑块、自相互作用或聚集倾向。所以高风险 FR 位点识别不是“编号、建模、算 RMSD”这么简单。它更像一个因果链FR 突变 → 局部结构变化 → 抗原结合几何变化 → 实验表型变化。只有把这条链串起来Framework 工程学才真正进入项目判断。否则我们只是得到很多指标却不知道哪个指标真的解释了实验结果。Framework 工程学真正要回答什么走到这里我们可以回到这篇文章的核心问题。CDR 没变为什么亲和力还是会掉因为 CDR 序列只是抗原识别信息的一部分。真正决定结合的是 CDR 在框架区支撑下形成的三维抗原结合表面。CDR 移植之所以成立是因为 CDR 确实承载了主要识别信息。CDR 移植之所以不总是成功是因为 CDR 依赖框架区环境。Vernier 支撑、重链/轻链取向、局部堆积、氢键网络、电荷环境、侧链方向和构象分布都会影响最终结合。所以Framework 工程学的第一课不是“哪些 FR 位点更像人”。而是哪些 FR 位点正在支撑亲本抗体的抗原结合表面如果一个 FR 位点正在支撑 CDR那么它就不能只按人源性评分处理。如果一个 FR 位点影响重链/轻链取向那么它就不能只看是否直接接触抗原。如果一个 FR 位点改变了表面斑块、自相互作用或聚集倾向那么它也不能只用亲和力数据放行。这就是人源化从“序列替换”进入“框架区工程”的地方。它要求我们不只是看一条候选像不像人还要看它能不能继续承载亲本 CDR、亲本结合方式和亲本功能表型。结语下一篇进入 human framework 选择与 back mutation保留 CDR不等于保留原来的抗原结合表面。因为抗体识别抗原依赖的不是 CDR 序列本身而是 CDR 在框架区支撑下形成的三维几何关系。Vernier Zone 让我们意识到一些不直接接触抗原的 FR 位点也可能决定 CDR 如何呈现。它们藏在 CDR 下面看起来不像界面残基却可能是亲本抗体结合成立的结构条件。所以人源化不能只问这条候选更像不像人还要问它是否仍然保留亲本抗体的 CDR 支撑、重链/轻链取向和抗原结合几何关系这也自然引出下一篇文章。如果框架区不是越人源越好而是要看它能不能承载亲本 CDR那么 human framework 的选择就不能只看序列相似度。最像的 framework未必最合适。有些鼠源框架区残基即使降低人源性也可能必须保留有些人源残基即使提高评分也可能破坏 CDR packing 或 VH/VL orientation。下一篇我们继续进入 Framework 工程学的第二个问题Framework 选得最像为什么不一定最好如果你也在做抗体人源化、结构建模或 AIDD 研发欢迎关注这个系列。我们不只讨论模型分数也讨论真实项目里那些让候选分子成败分开的结构细节。参考文献[1] Jones P T, Dear P H, Foote J, Neuberger M S, Winter G. Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse[J].Nature, 1986, 321: 522–525.[2] Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G. Reshaping human antibodies for therapy[J].Nature, 1988, 332: 323–327.[3] Queen C, Schneider W P, Selick H E, et al. A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1989, 86(24): 10029–10033.[4] Chothia C, Lesk A M. Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins[J].Journal of Molecular Biology, 1987, 196(4): 901–917.[5] Chothia C, Lesk A M, Tramontano A, et al. Conformations of immunoglobulin hypervariable regions[J].Nature, 1989, 342: 877–883.[6] Foote J, Winter G. Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops[J].Journal of Molecular Biology, 1992, 224(2): 487–499.[7] Dunbar J, Deane C M. ANARCI: antigen receptor numbering and receptor classification[J].Bioinformatics, 2016, 32(2): 298–300. 抗体人源化FR工程 | CDR 没变，为什么亲和力还是掉了？
如果 CDR 是抗原结合的核心区域那么保留 CDR为什么不能保证保留亲和力这是很多人第一次接触抗体人源化时最容易困惑的问题。从直觉上看CDR 是抗体识别抗原的核心。我们把鼠源抗体中最重要的 CDR 保留下来再把框架区换成人源似乎就应该既降低非人源风险又保留原来的抗原识别能力。但真实项目经常不会这么顺利。一条人源化候选序列CDR 完全保留人源化评分也提高了整体结构模型看起来没有明显问题可是 BLI 或 SPR 一测亲和力掉了 10 倍、20 倍甚至更多。再往下拆可能是解离变快也可能是结合变慢可能是细胞结合变弱也可能是阻断、激活或内吞功能直接掉下去。这个时候问题往往不是 CDR 序列有没有保留。问题是CDR 换到新的框架区以后原来的抗原结合几何关系还在不在。前面《人源化第一性原理》部分我们已经讲过三件事第一人源化不是简单把鼠源抗体改得更像人而是在降低非人源可变区风险的同时保住一个已经被实验验证过的抗体表型。第二鼠抗、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体不是从落后到先进的等级表而是不同研发处境下的工程选择。第三人源化评分、人源性评分和天然性评分都只是参考指标。它们可以帮助我们理解一条序列像不像人抗体但不能替代亲和力、功能、结构和可开发性验证。从这一篇开始我们进入Framework 工程学。它要回答的不是“框架区是什么”而是一个更真实的问题为什么很多抗体在人源化时明明保留了 CDR结合和功能还是会下降这篇文章先讲清楚什么这一篇不急着讨论所有 FR 位点怎么改也不急着给 back mutation 清单。我们先把底层逻辑讲清楚。第一CDR grafting 为什么一开始是合理的第二为什么 CDR 不能被理解成可以复制粘贴的模块第三Vernier Zone 为什么重要第四项目中如何理性识别高风险 FR 位点在进入今天的内容前先了解一下这几个术语。互补决定区Complementarity determining regionCDR抗体可变区中最主要参与抗原识别的高变区域。通常六条 CDR 共同形成抗体结合抗原的核心表面。框架区FrameworkFRCDR 之外的可变区结构区域。它不只是支架还会影响 CDR 环区构象、重链/轻链取向、局部堆积和抗体稳定性。CDR 移植CDR grafting经典人源化方法之一。基本思路是保留鼠源抗体 CDR将其移植到人源框架区上以减少非人源框架成分同时尽量保留原有抗原识别能力。抗原结合表面Paratope抗体上参与抗原识别的三维表面。它不等于 CDR 序列本身而是由 CDR、部分框架区残基、重链/轻链空间关系共同形成。Vernier 位点Vernier residues通常位于 CDR 下方或邻近区域的框架区残基。它们未必直接接触抗原却可能通过支撑 CDR、调节局部堆积和改变环区位置影响结合。重链/轻链取向VH/VL orientation抗体重链可变区和轻链可变区之间的相对空间关系。它决定六条 CDR 如何共同组成抗原结合表面。回复突变Back mutation在人源化候选中选择性恢复部分亲本鼠源框架区残基。它不是简单“改回去”而是为了恢复关键结构支撑或功能表型。Kabat、Chothia、IMGT 编号抗体可变区常见的编号系统。不同的系统在CDR边界定义和残基命名上略有差异因此在讨论FR、CDR或Vernier残基时必须明确使用哪种编号系统。CDR 移植为什么一开始看起来合理先说 CDR grafting 为什么成立。抗体可变区由 CDR 和 FR 组成。CDR 通常位于抗体可变区顶部是参与抗原识别最集中的区域。很多直接接触抗原的残基确实位于 CDR 中。因此如果一条鼠源抗体已经证明能结合某个靶点甚至已经在细胞实验中看到了明确功能那么保留它的 CDR是一个非常自然的工程先验。这也是经典 CDR 移植的出发点。Jones 等人在 1986 年 Nature 文章中把鼠源抗体 B1-8 重链可变区的 CDR 替换到人源骨髓瘤蛋白对应位置并观察到新抗体在与 B1-8 鼠源轻链组合时获得了 B1-8 对半抗原 NP-cap 的亲和力。这篇文章提出替换 CDR 可能成为从鼠源单抗构建人源化抗体的一种路线。这项工作的意义不是证明“只要保留 CDR 就一定成功”。它真正打开的是一个思路如果亲本抗体的抗原识别信息主要集中在 CDR那么 CDR 移植可以作为减少非人源框架区、同时尝试保留抗原识别能力的合理起点。后来的 Riechmann 等人在 1988 年 Nature 文章中将大鼠抗体的六条高变区引入人源抗体框架用于构建用于治疗方向的 reshaped human antibody。这也是早期人源化抗体路线中非常重要的工作。Queen 等人在 1989 年报道了针对人 IL-2 receptor p55 链的 humanized anti-Tac antibody也是早期人源化抗体工程的重要案例。这些工作共同说明了一件事保留 CDR 是合理起点但不是成功保证。因为 CDR 移植有一个隐含前提CDR 放到新的框架区以后还能保持原来的构象和相对位置。这恰恰是人源化最难的地方。CDR 不是可以复制粘贴的模块在 CDR 移植时会有一个误区既然 CDR 是主要结合区域那我把 CDR 保留下来不就保留结合能力了吗这个理解只对了一半。CDR 确实是抗原识别的核心区域但 CDR 不是悬浮在空气里的六条环。它们坐在框架区上受到框架区的支撑、约束和调节。有些框架区残基像地基从 CDR 下方托住环区有些影响重链和轻链的相对角度有些参与 β 折叠片层的内部堆积有些改变局部氢键网络还有一些靠近 CDR 的框架区残基甚至可能直接参与抗原接触。所以CDR grafting 的正确理解不是“复制 CDR”。更准确的说法是把一个已经验证过的抗原结合表面迁移到新的框架区环境中。这句话里最关键的是“环境”。同一条 CDR 序列在不同框架区上可能不是同一个结构状态。CDR 环区的高度可能变一点环区底部可能松一点某个芳香侧链可能换一个方向原来的氢键网络可能断开原来指向抗原的带电残基可能因为局部环境改变而重新取向。这些变化单独看都不大。但抗体结合本来就依赖局部几何。一个侧链转一点一个环区底部松一点一个口袋开口变一点最后都可能体现在解离变快、结合变慢、细胞结合下降或者功能实验里活性丢失。这也是 canonical structure 理论对人源化的提醒。Chothia 和 Lesk 在 1987 年提出抗体高变区 canonical structures 的概念指出许多高变区环的主链构象可以归入有限的结构类型并与环长、关键残基和部分框架区位置有关。后续 Chothia 等人在 1989 年 Nature 文章中进一步讨论了免疫球蛋白高变区构象与关键位点之间的关系。这给人源化一个重要提醒CDR 环区构象不是只由 CDR 序列自己决定。如果人源框架区不能提供原来鼠源框架区中的那组结构支撑即使 CDR 序列完全一样CDR 也可能以另一种方式呈现。而抗原识别依赖的不是 CDR 字符串。它依赖的是整个抗原结合表面的三维几何关系。Vernier Zone 到底是什么理解这一点以后Vernier Zone 就不是一个孤立术语了。它是解释“CDR 没变为什么亲和力还会掉”的关键机制之一。Foote 和 Winter 在 1992 年 Journal of Molecular Biology 文章中系统讨论了抗体框架区残基如何影响高变区环的构象并提出 Vernier zone 的概念。他们强调一些框架区残基虽然不一定直接接触抗原却可能影响高变区环的构象在人源化或环区移植中对这些位置进行有依据的选择可能对成功移植非常关键。所谓 Vernier residues可以理解为位于 CDR 下方或邻近区域的一组框架区残基。它们不一定直接接触抗原。如果只看抗原-抗体接触界面它们可能不会出现在接触残基列表里。如果只看序列比对它们可能只是普通 FR 位点。如果只看人源化评分模型甚至可能鼓励你把这些鼠源残基改成人源残基。但从结构上看它们可能正在支撑 CDR。真正接触抗原的 CDR 环在上面而 Vernier 位点在下面调节它的高度、角度、堆积和稳定性。某个位点从大侧链换成小侧链可能让 CDR 下方出现空隙从疏水残基换成极性残基可能改变局部堆积从芳香残基换成脂肪族残基可能让原本的芳香堆积或疏水支撑消失一个氢键供体或受体变化也可能让环区底部的相互作用网络重新排列。于是表面上 CDR 没变。但 CDR 站的位置变了。这就是 Vernier Zone 对人源化的工程意义。它提醒我们框架区残基的重要性不能只靠“是否直接接触抗原”来判断。很多真正危险的 FR 突变可能藏在 CDR 下方不在界面上却支撑着界面。这也是下一篇会讲到 back mutation 的基础。Back mutation 不是倒退而是对关键结构条件的选择性恢复。CDR 没变亲和力为什么会掉现在可以把问题拆得更具体一些。CDR 序列没变亲和力下降常见原因不止一种。第一种是 Vernier 支撑改变。比如某个框架区残基原本位于 CDR-H3 或 CDR-L1 下方提供疏水支撑。人源化时这个位点被替换成更符合人源框架的残基。人源性提高了但侧链体积变小CDR 下方堆积变松。CDR 主链可能只移动了很小的距离可是关键侧链的方向已经发生改变。第二种是 CDR 侧链方向改变。这点特别容易被忽略。CDR 主链 RMSD 很小不代表 CDR 侧链没有变。一个 Tyr、Trp、Arg、Asp 或 Asn 的侧链方向变化可能直接影响抗原接触。原来这个残基指向抗原可以形成氢键、芳香堆积、盐桥或疏水接触换了框架区以后局部环境变了它仍然在 CDR 序列里但侧链方向变了不再以原来的方式接触抗原。这时如果只看序列会觉得它没变。如果只看主链 RMSD也可能觉得变化不大。但真正支持结合的接触已经变了。第三种是重链/轻链取向改变。抗体的抗原结合表面不是由重链或轻链单独决定而是由 VH 和 VL 共同组成。六条 CDR 不是孤立存在而是在重链/轻链配对后形成一个整体表面。如果框架区替换影响了 VH/VL 界面即使每条 CDR 自身变化不大六条 CDR 之间的相对位置也可能改变。原来形成口袋的重链和轻链残基可能开口变宽或变窄原来能同时接触抗原两个区域的侧链可能距离不再合适。它不是 CDR “丢了”。而是 CDR 之间的空间关系变了。第四种是局部氢键、盐桥和电荷网络改变。框架区和 CDR 之间可能存在局部氢键网络或盐桥。某个 FR 突变不直接接触抗原却可能改变环区底部稳定性改变关键侧链方向或者改变结合表面的电荷环境。这类变化可能影响解离速度也可能影响结合速度。如果复合物稳定性下降常常表现为解离变快。如果抗体在未结合状态下的预组织状态变差或者结合表面的电荷引导发生变化可能表现为结合变慢。第五种是结合前后的构象分布改变。亲和力不是静态结构截图。它背后是自由能差。人源化可能改变抗体在未结合状态下的构象分布。即使结合后模型看起来接近未结合状态下的环区柔性、预组织状态和诱导契合代价也可能已经变了。换句话说CDR 没变不代表结合过程没变。一个抗体能不能高效结合抗原不仅取决于结合后能形成什么接触也取决于结合前它是否已经以合适的构象准备好了。这就是为什么结构模型很重要但不能被简单使用。结构模型不是为了给我们一个 RMSD 数字。它更重要的作用是帮助我们提出机制假设。项目中怎么识别高风险 FR 位点这一部分很容易写成步骤清单但真实项目不是照着菜单走。更合理的做法是围绕一个核心问题展开哪些 FR 突变最可能解释实验表型的变化比如拿到一批人源化候选发现有些候选亲和力掉得很厉害有些候选还能保住功能。这个时候不应该先急着把所有结构指标都算一遍而是要把分析拆成三层。第一层先确定“改了什么”。也就是把亲本抗体和人源化候选放到同一个编号体系下明确 CDR 和 FR 的边界列出所有 FR 突变。这里需要说明使用 Kabat、Chothia、IMGT 还是 AHo 编号因为不同体系对 CDR 边界的定义并不完全一致。ANARCI 这类工具可以帮助完成抗体可变区编号并支持 Kabat、Chothia、IMGT、AHo 等常见编号体系。这一步的目的不是做一张突变表就结束。而是回答哪些位点从鼠源变成了人源哪些位点位于 CDR 附近哪些位点靠近重链/轻链界面哪些位点埋在结构内部哪些位点可能属于 Vernier 区域第二层再判断“这些变化可能影响什么”。这里就要进入结构。如果有亲本抗体或复合物的实验结构优先使用实验结构。如果没有可以使用 AF3、ABodyBuilder、RosettaAntibody、IgFold 等工具建立亲本和候选结构。关键不是迷信某一个模型而是尽量保证亲本和候选使用可比较的建模流程避免把工具差异误认为突变差异。结构比较时不要只看整体 RMSD。整体 RMSD 很小只能说明模型总体没有散。人源化真正要看的是局部关系有没有变。CDR 下方 4–6 Å 范围内的 FR 残基有没有变化CDR base 的堆积有没有变松Vernier 位点是否从大侧链变成小侧链芳香堆积是否消失局部氢键网络是否断开重链/轻链界面的相互作用是否改变关键 CDR 侧链是否还指向抗原4–6 Å 只是经验窗口不是机械标准。真正重要的是这些位点是否参与支撑、堆积、取向和界面形成。第三层最后把结构变化和实验表型对上。这是最容易被忽略的一步。如果某个候选 KD 掉了 20 倍要继续拆是结合变慢还是解离变快如果主要是解离变快那要重点看复合物界面接触是否丢失、CDR 侧链方向是否变化、Vernier 支撑是否让结合后状态不稳。如果主要是结合变慢那要重点看未结合状态的预组织、表面电荷引导、CDR 环区柔性和构象分布。如果细胞结合下降但纯蛋白亲和力变化不大就要考虑抗原在细胞膜上的构象、表位可及性、抗体结合角度和空间位阻。如果亲和力保住了但功能掉了就不能只盯着 KD。阻断抗体要看竞争关系激动抗体要看受体聚集方式内吞抗体要看结合后的细胞过程带 Fc 功能的抗体还要看效应功能。如果 binding 和 function 都还可以但 SEC、HIC 或 AC-SINS 出问题那说明风险可能不在抗原结合界面而在表面疏水斑块、电荷斑块、自相互作用或聚集倾向。所以高风险 FR 位点识别不是“编号、建模、算 RMSD”这么简单。它更像一个因果链FR 突变 → 局部结构变化 → 抗原结合几何变化 → 实验表型变化。只有把这条链串起来Framework 工程学才真正进入项目判断。否则我们只是得到很多指标却不知道哪个指标真的解释了实验结果。Framework 工程学真正要回答什么走到这里我们可以回到这篇文章的核心问题。CDR 没变为什么亲和力还是会掉因为 CDR 序列只是抗原识别信息的一部分。真正决定结合的是 CDR 在框架区支撑下形成的三维抗原结合表面。CDR 移植之所以成立是因为 CDR 确实承载了主要识别信息。CDR 移植之所以不总是成功是因为 CDR 依赖框架区环境。Vernier 支撑、重链/轻链取向、局部堆积、氢键网络、电荷环境、侧链方向和构象分布都会影响最终结合。所以Framework 工程学的第一课不是“哪些 FR 位点更像人”。而是哪些 FR 位点正在支撑亲本抗体的抗原结合表面如果一个 FR 位点正在支撑 CDR那么它就不能只按人源性评分处理。如果一个 FR 位点影响重链/轻链取向那么它就不能只看是否直接接触抗原。如果一个 FR 位点改变了表面斑块、自相互作用或聚集倾向那么它也不能只用亲和力数据放行。这就是人源化从“序列替换”进入“框架区工程”的地方。它要求我们不只是看一条候选像不像人还要看它能不能继续承载亲本 CDR、亲本结合方式和亲本功能表型。结语下一篇进入 human framework 选择与 back mutation保留 CDR不等于保留原来的抗原结合表面。因为抗体识别抗原依赖的不是 CDR 序列本身而是 CDR 在框架区支撑下形成的三维几何关系。Vernier Zone 让我们意识到一些不直接接触抗原的 FR 位点也可能决定 CDR 如何呈现。它们藏在 CDR 下面看起来不像界面残基却可能是亲本抗体结合成立的结构条件。所以人源化不能只问这条候选更像不像人还要问它是否仍然保留亲本抗体的 CDR 支撑、重链/轻链取向和抗原结合几何关系这也自然引出下一篇文章。如果框架区不是越人源越好而是要看它能不能承载亲本 CDR那么 human framework 的选择就不能只看序列相似度。最像的 framework未必最合适。有些鼠源框架区残基即使降低人源性也可能必须保留有些人源残基即使提高评分也可能破坏 CDR packing 或 VH/VL orientation。下一篇我们继续进入 Framework 工程学的第二个问题Framework 选得最像为什么不一定最好如果你也在做抗体人源化、结构建模或 AIDD 研发欢迎关注这个系列。我们不只讨论模型分数也讨论真实项目里那些让候选分子成败分开的结构细节。参考文献[1] Jones P T, Dear P H, Foote J, Neuberger M S, Winter G. Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse[J].Nature, 1986, 321: 522–525.[2] Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G. Reshaping human antibodies for therapy[J].Nature, 1988, 332: 323–327.[3] Queen C, Schneider W P, Selick H E, et al. A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1989, 86(24): 10029–10033.[4] Chothia C, Lesk A M. Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins[J].Journal of Molecular Biology, 1987, 196(4): 901–917.[5] Chothia C, Lesk A M, Tramontano A, et al. Conformations of immunoglobulin hypervariable regions[J].Nature, 1989, 342: 877–883.[6] Foote J, Winter G. Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops[J].Journal of Molecular Biology, 1992, 224(2): 487–499.[7] Dunbar J, Deane C M. ANARCI: antigen receptor numbering and receptor classification[J].Bioinformatics, 2016, 32(2): 298–300.