PCR基础原理PCR即聚合酶链式反应模拟生物体内DNA天然复制机制依靠温控循环在体外特异性扩增目标DNA片段整套反应依靠变性→退火→延伸三步循环往复实现片段富集。三步循环详解1、高温变性94~98℃高温打破双链氢键双链DNA解旋解离为两条单链为引物结合创造条件。2、低温退火55~65℃温度回落上下游引物依靠碱基互补配对精准结合在模板DNA的目标侧翼序列引物Tm值直接决定退火温度引物设计是PCR成败关键。3、中温延伸72℃Taq DNA聚合酶发挥催化活性以dNTP为原料从引物3’端起始沿模板链合成互补DNA新链延伸时长根据目的片段长度计算常规速率1000bp/min。整套循环重复25~35轮指数式扩增目的片段。25μL常规PCR体系配比试剂添加体积2×Taq酶12.5 μL上游引物 Primer11 μL下游引物 Primer21 μL模板 DNA1~2 μL无菌 ddH₂O补水定容至 25 μL标准PCR温控程序预变性95℃3 min彻底解开复杂模板双链循环段25~35个循环变性95℃15 s退火55~60℃15~30 s随引物Tm灵活调整延伸72℃按片段长度定时1kb≈1min终末延伸72℃5 min补齐末端片段低温保温16℃2 min新手避坑小贴士1、退火温度参考引物Tm值引物GC含量越高所需退火温度越高。2、模板添加量不宜过多过量模板容易引发非特异性杂带。3、片段2kb时适当延长延伸时间保证扩增完整。
PCR基础原理PCR即聚合酶链式反应模拟生物体内DNA天然复制机制依靠温控循环在体外特异性扩增目标DNA片段整套反应依靠变性→退火→延伸三步循环往复实现片段富集。三步循环详解1、高温变性94~98℃高温打破双链氢键双链DNA解旋解离为两条单链为引物结合创造条件。2、低温退火55~65℃温度回落上下游引物依靠碱基互补配对精准结合在模板DNA的目标侧翼序列引物Tm值直接决定退火温度引物设计是PCR成败关键。3、中温延伸72℃Taq DNA聚合酶发挥催化活性以dNTP为原料从引物3’端起始沿模板链合成互补DNA新链延伸时长根据目的片段长度计算常规速率1000bp/min。整套循环重复25~35轮指数式扩增目的片段。25μL常规PCR体系配比试剂添加体积2×Taq酶12.5 μL上游引物 Primer11 μL下游引物 Primer21 μL模板 DNA1~2 μL无菌 ddH₂O补水定容至 25 μL标准PCR温控程序预变性95℃3 min彻底解开复杂模板双链循环段25~35个循环变性95℃15 s退火55~60℃15~30 s随引物Tm灵活调整延伸72℃按片段长度定时1kb≈1min终末延伸72℃5 min补齐末端片段低温保温16℃2 min新手避坑小贴士1、退火温度参考引物Tm值引物GC含量越高所需退火温度越高。2、模板添加量不宜过多过量模板容易引发非特异性杂带。3、片段2kb时适当延长延伸时间保证扩增完整。
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